ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS
La estructura primaria de las proteínas está constituida por el tipo y secuencia aminoacídica. La secuencia depende solo de los enlaces covalentes (peptídicos)
y es predeterminada por el código del ADN.
La secundaria está formada por la disposición en espiral de la cadena polipeptídica de la estructura primaria, en una dimensión. Esta estructura, en muchas proteínas globulares, presenta dilataciones, plegamientos y enrollados, debidos a muchos enlaces de hidrógeno y, de manera ocasional, a enlaces covalentes disulfuro.
La terciaria es la estructura constituida por el plegamiento intramolecular de la cadena polipeptídica para formar una estructura tridimensional compacta de forma específica y que se mantiene por los enlaces electro-valentes, los enlaces hidrógeno, los puentes disulfuro, las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas. Estas últimas son consideradas la fuerza mayor en la conservación de la estructura terciaria, la cual le confiere a las proteínas sus propiedades biológicas específicas.
La estructura cuaternaria está representada por la asociación de varias cadenas polipeptídicas que forman una gran unidad de agregados oligoméricos. Esta estructura se consolida con el estrecho ajuste de las unidades polipeptídicas a través de contactos de su superficie con los grupos prostéticos. La albúmina, por ejemplo, carece de estructura cuaternaria, pues posee solo una cadena polipeptídica. Sin embargo, la enzima creatin-quinasa,
constituida por dos cadenas polipeptídicas, tiene tres isoformas enzimáticas mayores, que dan lugar, en ella, a varias estructuras cuaternarias.
PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS
Las propiedades físico-químicas de las proteínas se utilizan como base para su identificación, separación y cuantificación. Ellas constituyen los principios o fundamentos de los métodos para su estudio.
Las proteínas pueden ser separadas, desde el punto de vista físico, de acuerdo con su tamaño. Su masa molecular relativa permite la separación de las moléculas grandes o pequeñas mediante la diálisis o la filtración en gel. La densidad de muchas proteínas es de aproximadamente 1,33 con excepción de las lipoproteínas, en las cuales oscila entre 1,006 y 1,21, lo cual permite la separación de estas por medio de la ultra-centrifugación.
La solubilidad, otra propiedad de las proteínas, está dada por la afinidad que tienen por diferentes solventes.
Si esta se pierde, al modificarse las propiedades físico-químicas del solvente (pH, fuerza iónica, constante dieléctrica, temperatura) por medio de experimentos, se produce la precipitación de las proteínas al estado de insolubilidad. Lo mismo ocurre cuando las proteínas son desnaturalizadas por la acción de agentes físicos como el calor o por distintas sustancias como la
urea, el dodecilsulfato de sodio, y ácidos y bases débiles, lo que produce la destrucción de sus estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria.
Hasta hace pocos años fue muy utilizado el método conocido como precipitación salina (salting out) para separar proteínas. La caída de la constante dieléctrica del solvente, producida por la adición de sales o solventes
orgánicos, da origen a la separación y precipitación de las proteínas.
Los análisis cuantitativos del contenido proteico en la orina y en el líquido cefalorraquídeo (LCR), se basan, por lo general, en los siguientes principios:
1. Reacción de los enlaces polipeptídicos con iones de cobre en solución alcalina (reacción Biuret) o de los residuos de tirosina y triptófano de los aminoácidos en soluciones fenoladas (método de Lowry).
2. Absorción ultravioleta (UV) en los intervalos de 200 a 255 nm y de 270 a 290 nm.
3. La precipitación y posterior cuantificación con métodos turbidimétricos o nefelométricos.
4. La unión a colorantes indicadores como: azul brillante Coomassie, rojo Ponceau S, bromocresol verde y bromocresol púrpura.
OTROS PRINCIPIOS Y TÉCNICAS PARA LA SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
Además de los referidos antes, existen otros principios y técnicas para la separación y cuantificación de las proteínas. Algunos, descritos hace varias décadas, se mantienen vigentes hoy día y otros forman parte de los procederes nuevos que han surgido al amparo de nuevas tecnologías introducidas en años recientes. A continuación se exponen algunos.
ELECTROFORESIS
El principio de la electroforesis se basa en que las partículas cargadas, en este caso las proteínas, ubicadas en un campo eléctrico, migran hacia uno de los
electrodos del campo, en dependencia de:
1. La carga eléctrica de la partícula.
2. El tamaño de la partícula.
3. La fuerza del campo eléctrico.
4. Las características del medio utilizado como soporte durante el proceso de la migración.
Las partículas cargadas negativamente (aniones) se dirigen al ánodo (electrodo positivo), y las cargadas positivamente (cationes) se dirigen al cátodo (electro-do negativo). Si se hace variar el pH de la solución amortiguadora, en la cual están disueltas las proteínas, estas migrarán en el campo eléctrico creado, y se se-pararán unas de otras, al migrar cada una de ellas distancias diferentes. Esta migración se produce sobre un soporte que puede estar constituido por soluciones coloidales, geles (agar, almidón, agarosa, acrilamida) o papel (de filtro o acetato de celulosa). En el caso de la electroforesis en papel de acetato de celulosa, una vez separadas las fracciones, son coloreadas y luego cuantificadas.
Para ello se utiliza la técnica densitométrica, descrita en otra sección de este libro. El gráfico que se obtiene, conocido como electroforegrama o patrón electroforético, lo componen (cuando se utiliza el papel como soporte), en un orden de izquierda a derecha, las fracciones siguientes:
1. Albúmina.
2. Alfa 1 globulinas.
3. Alfa 2 globulinas.
4. Betaglobulinas.
5. Gammaglobulinas.
Los espacios que ocupan estas fracciones, se conocen como zonas del electroforegrama y reciben el nombre de la fracción correspondiente.
La correcta interpretación del patrón electroforético requiere del conocimiento de la semiología de cada una de las fracciones que lo constituyen.
La albúmina es la principal proteína producida por el hígado y representa más de la mitad del contenido proteico total del suero. Es la proteína más homogénea, la más soluble y la más estable de las que se encuentran en el plasma.
Sus funciones más importantes las realiza manteniendo la presión osmótica, transportando una gran variedad de sustancias, y como fuente endógena para el suministro de aminoácidos. Puede ser metabolizada por cualquier órgano del cuerpo humano.
El aumento en la concentración sérica de la albúmina se produce, por lo general, durante la deshidratación (aumento relativo), la administración intravenosa de concentrados de esta proteína o por error en su de-terminación
en el laboratorio. Los trastornos más frecuentes que tienen relación con este componente, se corresponden con su disminución, conocida como hipoalbuminemia y que se acompaña casi siempre del signo clínico del edema.
La hipoalbuminemia aparece en numerosas enfermedades, asociada con otros signos clínicos (tabla 2.1).
Tabla 2.1 Causas de la hipoalbuminemia
Enfermedades Causas de la hipoalbuminemia
Enfermedad hepática Disminución en la síntesis por:
Enfermedad hepática intrínseca
Alcoholismo
Desnutrición
Enfermedad renal Aumento de las pérdidas por:
Rápida degradación Aumento de la presión oncótica en suero (uremia)
Desnutrición
Enfermedad gastrointestinal Aumento de las pérdidas por:
Obstrucción hepática
Malabsorción
Desnutrición
Enfermedad pulmonar Aumento de las pérdidas por:
Expectoración
Daño hepático
Aumento en la producción de globulina y reactantes de la fase aguda
Quemaduras Aumento de las pérdidas por:
Exudación intensa
Recirculación anormal
Daño hístico extenso
Los métodos utilizados para su cuantificación son los siguientes:
1. Electroforéticos.
2. Inmunoquímicos: electroinmunodifusión, inmunodifusión radial, turbidimétricos y nefelométricos.
3. Unión a colorantes indicadores: bromocresol verde y bromocresol púrpura.
En la zona de las alfaglobulinas migra un conjunto de proteínas que se conocen como alfa 1 globulinas y alfa 2 globulinas. Las alfa 1 globulinas están representadas por las siguientes:
1. Alfa 1 antitripsina: proteína inhibidora de la tripsina y la plasmita, cuya función es proteger al organismo de la autodigestión. Forma parte del grupo de los reactantes de la fase aguda. Aumenta en las enfermedades inflamatorias y disminuye en la deficiencia congénita de esta proteína, enfermedad cuyo cuadro clínico se caracteriza por presentar enfisema pulmonar asociado con insuficiencia hepática.
2. Alfa 1 glicoproteína ácida: es un reactante de la fase aguda.
3. Alfa 1 lipoproteína: transportadora de lípidos, vita-minas
liposolubles y hormonas.
4. Globulina unida a la tiroxina.
5. Alfa 1 fetoproteína: sintetizada por el hígado embrionario.
Su determinación constituye una prueba diagnóstica para los defectos del tubo neural y es un marcador tumoral para el carcinoma de células embrionarias del testículo, teratocarcinomas, cáncer gástrico, pulmonar y hepatocelular.
En el grupo de las alfa 2 globulinas se incluyen las siguientes:
1. Alfa 2 macroglobulina: es una inhibidora de la plasmina y la tripsina.
2. Alfa 2 lipoproteína: transportadora de lípidos, en especial, triglicéridos.
3. Haptoglobina: reactante de la fase aguda y además transportadora de la hemoglobina libre en plasma.
El estudio de sus niveles se utiliza cuando hay hemólisis en las reacciones ostransfusionales. En los pacientes que han sufrido reacciones postransfu-sionales, disminuye la concentración de haptoglobina al agotarse la capacidad del hígado para sintetizarla, ante la demanda excesiva por la cantidad de hemoglobina que debe transportar.
4. Ceruloplasmina: proteína transportadora del cobre.
5. Colinesterasa: proteína que hidroliza la acetilcolina.
Las betaglobulinas agrupan a las siguientes:
1. Betalipoproteína: transportadora de lípidos.
2. Transferrina: proteína transportadora del hierro en suero. También se une de manera reversible a otros cationes como cobre, cinc, cobalto y calcio. Los
niveles plasmáticos son regulados por la disponibilidad de hierro. Como se sintetiza en el hígado, sus valores pueden disminuir en enfermedades hepáticas agudas como las hepatitis y en las crónicas, en la desnutrición y enteropatías con pérdida de proteínas.
Sus niveles plasmáticos varían en la anemia por déficit de hierro, lo cual causa un incremento en su síntesis. Por el contrario, si la anemia se debe a una falla en la incorporación del hierro a los eritrocitos, sus niveles son normales o bajos. En la sobrecarga de hierro, sus valores son normales, pero la saturación es muy alta.
3. Plasminógeno: proteína encargada de la lisis de la fibrina.
4. Complemento: constituido por un grupo de proteínas que intervienen en la propiedad fagocítica de la sangre.
5. Fibrinógeno: factor proteico de la coagulación de la sangre.
Las gammaglobulinas agrupan a las llamadas inmunoglobulinas, constituidas por cinco fracciones diferentes:
G, A, M, D y E.
Todas tienen funciones de anticuerpos contra virus, bacterias y parásitos. En las enfermedades autoinmunes se comportan como autoanticuerpos al actuar contra células del organismo al cual pertenecen.
INMUNOELECTROFORESIS
La inmunoelectroforesis combina el poder de separación de la electroforesis con la capacidad resolutiva de la inmunoprecipitación, basada en la especificidad inmunológica.
Después de realizar la electroforesis a las muestras de suero, se depositan en pocillos individuales, un suero polivalente (antinmunoglobulinas total) y sueros mono-valentes (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti kappa y anti lambda). El antígeno y el antisuero difunden el uno hacia el otro, y se produce una banda de precipitina cuando alcanzan la zona de equivalencia.
La inmunoelectroforesis tiene su indicación precisa cuando se aprecian anormalidades en el estudio electroforético realizado antes.
El patrón electroforético normal es de fácil interpretación.
Lo mismo ocurre cuando adopta características especiales que identifican a un buen grupo de enfermedades (figuras 2.5 y 2.6).
Un ejemplo de ello se observa cuando en la zona de las alfaglobulinas, de las betaglobulinas o de las gamma-globulinas, zonas que por lo general no tienen picos, aparece un pico proteico, de base estrecha, que señala la presencia de una proteína monoclonal. La inmunoelectroforesis mantiene su vigencia diagnóstica, al igual que la electroforesis y la cuantificación de las inmunoglobulinas, cuando un patrón con estas características está presente.
Las células productoras de inmunoglobulinas (células plasmáticas y linfocitos) tienen una función muy especializada.
Cada una de ellas, agrupadas en clones, produce la misma clase y tipo de inmunoglobulina. La proliferación de estas células, conocidas como inmunocitos, puede ocurrir en varios grupos de ellas, que dan lugar a varias clases y tipos de inmunoglobulinas. En este caso, se dice que la afectación es policlonal (varios clones) y su expresión en el patrón electroforético se caracteriza por un pico proteico no pronunciado, con una base ancha. Si la proliferación ocurre de forma aislada en un grupo celular que produce una clase y tipo de inmunoglobulina, la afectación es monoclonal (un clon) y su expresión en el patrón electroforético se caracteriza por un pico proteico muy pronunciado, con base estrecha, en la zona de las alfaglobulinas, betaglobulinas o gammaglobulinas (figura 2.6, esquemas VII, VIII, IX y X).
La respuesta de los inmunocitos en las enfermedades infecciosas e inflamatorias crónicas es siempre policlonal. En el caso opuesto, cuando la respuesta es monoclonal, en el 45 % de los pacientes constituye un signo de malignidad y se relaciona con enfermedades como mieloma múltiple, amiloidosis, enfermedades linfoproliferativas, plasmocitoma solitario y macroglo-bulinemia.
INMUNOFIJACIÓN ELECTROFORÉTICA
La inmunofijación electroforética ofrece una elevada resolución, por lo que facilita la identificación de proteínas monoclonales en cantidades mínimas. Se basa en la combinación de la electroforesis seguida por la inmunoprecipitación. Las tiras de acetato de celulosa se saturan con antisuero monoespecífico y se aplican a proteínas séricas, antes separadas por electroforesis, en sus respectivas zonas de migración. Durante la incubación, los complejos inmunes formados pueden ser identificados como bandas diferentes. Aunque este método es muy sensible, tiene algunas desventajas, como son: el elevado costo de los antisueros monoespecíficos y la gran cantidad que de ellos se necesita para empapar las tiras de acetato.
TURBIDIMETRÍA
La turbidimetría es uno de los dos métodos que involucra la interacción de la luz con partículas en solución.
Estas disminuyen la trasmisión de la luz debido a la reflexión, dispersión y absorción del rayo luminoso.
Es un método sensible y sigue la ley de Beer en un amplio rango de concentraciones.
NEFELOMETRÍA
La nefelometría es una técnica similar a la turbidimetría y se utiliza cuando las partículas en solución son pequeñas y en escasa concentración. Se emplea con frecuencia para medir la dispersión de la luz, que ocurre como resultado de la reacción antígeno-anticuerpo, lo que permite su cuantificación. Entre sus ventajas se encuentran las siguientes: rapidez, reactivos simples y posibilidades de automatización. Es una metodología simple y precisa. Sus principios se exponen en otra sección de este libro.
INMUNODIFUSIÓN RADIAL
La inmunodifusión radial es un método para cuantificar proteínas mediante una reacción con difusión única en una dimensión.
Los sueros de referencia (calibradores), controladores y muestras, se colocan en pocitos ponchados en gel de agarosa que contiene el antisuero monoespecífico.
El antígeno presente en la muestra difunde de forma radial a través del gel y forma un anillo de precipitación, al unirse al anticuerpo presente en el antisuero monoespecífico (reacción antígeno-anticuerpo).
El diámetro de los anillos se mide, y se calculan los valores. Antes de disponerse de la nefelometría, este método fue muy utilizado para la cuantificación de las inmunoglobulinas.
RADIOINMUNOENSAYO Y ENSAYO INMUNORRADIOMÉTRICO
El principio en que se basan las técnicas de radioin-munoensayo (RIA) y de ensayo inmunorradiométrico (IRMA) es el mismo para ambas. En las dos se utiliza un antígeno marcado con un isótopo (el más frecuente es el 125 I). El antígeno marcado compite por los sitios de unión en el anticuerpo. En este sistema, la avidez del anticuerpo por el antígeno marcado y el no marcado, debería ser igual. Para conocer la cantidad de proteína (antígeno) presente, se obtiene la cuantificación del antígeno marcado, al separar el anticuerpo que está unido al antígeno marcado del antígeno marcado libre.
Esta separación puede lograrse por 3 vías:
1. Absorción del antígeno libre marcado.
2. Precipitación de los antígenos marcado y no marcado unidos al anticuerpo.
3. Uso de anticuerpos de fase sólida para atraer los anticuerpos unidos al antígeno marcado y no marcado.
La inmunorradiometría, a diferencia del RIA, utiliza, en lugar de antígenos, anticuerpos marcados con isótopos. En este tipo de ensayo, el ligando en las muestras compite con el ligando unido a una superficie sólida (tubos o perlas de vidrio recubiertas) por los sitios de unión del anticuerpo marcado. Hay entonces una competencia entre el ligando unido a una superficie sólida y el ligando de la muestra con el anticuerpo marcado. La cantidad de anticuerpo marcado unido a la superficie sólida, es detectada después que el exceso del anticuerpo marcado y la muestra se han eliminado. De nuevo hay una relación
inversa entre la cantidad de radiactividad detectada en el tubo y la concentración del ligando en la muestra desconocida.
ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS
Los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) son métodos muy útiles para la cuantificación de proteínas y se utilizan mucho en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, endocrinas y autoinmunes. Estos requieren de la separación del complejo antígeno-anticuerpo.
Las variantes más comunes son:
1. Método indirecto para la detección de anticuerpos.
2. Método de doble anticuerpo (sándwich) para la detección de antígenos.
Las características del ensayo inmunoenzimático han sido estudiadas en otra sección de este libro. Este método ha desplazado bastante al RIA, al dejar a un
lado las implicaciones que tiene trabajar con material radiactivo. En cuanto a la sensibilidad, el ELISA es similar al RIA, aunque su especificidad es discretamente menor. Los reactivos son estables y las lecturas se pueden realizar en un espectrofotómetro común.
Mención aparte merece la electroquimioluminiscencia, principio que ha invadido el mercado internacional al incorporarse a una gran variedad de equipos automáticos que han simplificado, de forma drástica, los análisis de hormonas, marcadores tumorales, marcadores para anemias, infarto de miocardio y dosificaciones de medicamentos en san-gre.
La electroquimioluminiscencia ocurre con numerosas moléculas como rutenio, osmio y renio. Con el uso del rutenio quelado, como complejo para el desarrollo de luz, se ha hecho posible la determinación de aminoácidos, haptenos y ácidos nucleicos. Este método ha sido descrito en otra sección de este libro (véase el capítulo sobre inmunoquímica).
REACTANTES DE LA FASE AGUDA
Casi todas las proteínas plasmáticas se sintetizan en el hígado, con la excepción de las inmunoglobulinas y las hormonas proteicas. Son múltiples las enfermedades en las cuales se alteran la cantidad y las proporciones de estas proteínas en los líquidos corporales, como ocurre, por ejemplo, en las reacciones inflamatorias que aparecen durante la evolución del infarto del miocardio (IMA), infecciones, tumores, y después de intervenciones quirúrgicas. Las proteínas plasmáticas que sufren alteraciones durante la inflamación, se conocen como reactantes de la fase aguda (RFA). Se supone que este grupo proteico juega un importante papel en el complejo proceso de la inflamación (cuadro 2.1).
Cuadro 2.1 Causas de la elevación de los reactantes de la fase aguda
Enfermedades inflamatorias
Enfermedades malignas
Traumatismos
Posoperatorio
Enfermedades autoinmunes
Los niveles plasmáticos de los RFA se elevan en tiempos diferentes. En primer lugar lo hacen la proteína C reactiva (PCR) y la alfa 1 antitripsina; 12 horas después, se elevan la alfa 1 glicoproteína ácida, la haptoglobina, la fracción C4 del complemento y el fibrinógeno. Las últimas en elevarse son la ceruloplasmina y la fracción C3 del complemento. Todas alcanzan su máxima concentración entre 2 y 5 días. Los cambios en su concentración, que responden a un aumento en la síntesis por parte del hígado, no permiten conocer ni la ubicación ni las causas de la reacción inflamatoria, pero constituyen una excelente herramienta para controlar, desde el punto de vista evolutivo, su progreso o desaparición y, por lo tanto, la eficacia o no del tratamiento impuesto (tabla 2.2).
Tabla 2.2 Respuesta de los reactantes de la fase aguda ante el proceso inflamatorio
Reactantes Elevación de los resultados
Comienzo(h) Pico máximo (h)
Proteína C reactiva 2 48
Alfa 1 antitripsina 8 72 - 120
Alfa 1 glucoproteína ácida 8 72 - 120
Haptoglobina 8 72 - 120
C3 y C4 8 72 - 120
Fibrinógeno 8 72 - 120
El aumento de la síntesis de las proteínas de la fase aguda, se acompaña de la disminución de la prealbúmina, de la albúmina y de la transferrina, que constituyen los llamados reactantes de la fase negativa.
Por lo general, las proteínas de la fase aguda forman parte del grupo de las alfa 1 globulinas y alfa 2 globulinas.
Estas, a su vez, constituyen la llamada zona de las alfa en el diagrama electroforético.
El fibrinógeno, proteína de la fase aguda, influye en la determinación de la velocidad de sedimentación eritrocitaria (VSG). En las enfermedades hepáticas crónicas, la concentración del fibrinógeno disminuye, y su efecto acelerador sobre la VSG queda a cargo de la albúmina, que disminuye, y de las globulinas, que aumentan.
LAS ALFAGLOBULINAS Y LAS BETAGLOBULINAS EN LA VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN ERITROCITARIA
La albúmina es estabilizadora de la VSG. En las infecciones agudas, la albúmina plasmática disminuye y las alfaglobulinas y el fibrinógeno aumentan, combinación que acelera la VSG y que constituye la causa principal de esta aceleración en afecciones como la nefrosis y la cirrosis.
En el mieloma múltiple, la VSG se acelera de manera considerable. La formación de pilas de monedas, originadas por la sedimentación rápida de los eritrocitos, impide muchas veces que se extienda, de forma adecuada, la sangre periférica sobre el portaobjetos. Aunque el cuadro proteico plasmático es muy variable en esta enfermedad, por lo general hay una gran concentración proteica en la zona de las globulinas (pico monoclonal, paraproteína) y una discreta disminución de la albúmina. Estas alteraciones proteicas en el plasma delos pacientes, causan la aceleración de la VSG por encima de 100 mm/h.
En la VSG, la sedimentación de los eritrocitos transita por 3 fases (A, B, C):
A: fase inicial, de pocos minutos, durante la cual se forman las pilas de monedas.
B: fase que tiene una duración de 30 minutos a 2 horas, que depende de la longitud de la pipeta y en el transcurso de la cual la sedimentación ocurre a una velocidad constante.
C: fase lenta, en la que se produce el empaquetamiento de la columna de eritrocitos.
La fase B es la más importante. La VSG debe “montarse” preferiblemente antes de transcurrir 2 horas de tomada la muestra. En determinadas circuns-tancias, este período puede prolongarse hasta 6 horas, pero no más, pues se invalidan sus resultados.
La VSG se determina con métodos manuales y automáticos. Entre los métodos manuales, el más utilizado es el de Westergreen en cualquiera de sus modificaciones.
Para el uso en pediatría, existen las microtécnicas.
CARACTERÍSTICAS DE LAS PROTEÍNAS COMPRENDIDAS EN EL GRUPO DE LOS REACTANTES DE LA FASE AGUDA
Proteína C reactiva (PCR). Esta proteína fue identificada en 1930, en el suero de pacientes con neumonía causada por neumococos y se comprobó que
podía unirse al polisacárido C del Streptococcus pneumoniae, y producir floculación. Luego, se detectó su presencia en otras enfermedades inflamatorias agudas.
La PCR fue el primer reactante de la fase aguda que se identificó. Es sintetizada por el hígado y se vierte en el plasma. Un subgrupo de los linfocitos también la produce en pequeñas cantidades, pero en este caso permanece unida a la superficie celular. Su elevación en el plasma se produce a las 2 horas, y alcanza su máxima concentración a las 48 horas. Esta proteína constituye el marcador de la inflamación por excelencia y tiene numerosas funciones como: dar comienzo a la opsonización, a la fagocitosis y a la activación del complemento, de los neutrófilos y de los monocitos macrófagos. Estas propiedades le permiten jugar un importante papel en el reconocimiento
de organismos microbianos y como inmunomodulador en el huésped. También es importante para el reconocimiento de los tejidos necrosados. Durante muchos años fue poco utilizada, a pesar de conocerse su importancia como marcador inflamatorio. A comienzos de la década de los 90 del siglo XX, se prestó atención una vez más a sus posibilidades de diagnóstico y aparecieron publicaciones más completas, que volvieron a situarla entre las determinaciones más utilizadas en el laboratorio clínico. Un hecho importante en su revalorización, lo fue la comparación de esta prueba con otra, muy utilizada desde hace años como marcador no específico de la actividad de los procesos patológicos: la VSG.
La PCR tiene algunas ventajas en relación con la VSG. Entre ellas sobresale el hecho de que el fibrinógeno, las proteínas monoclonales y la morfología eritrocitaria, no son causas de interferencia. Al igual que la VSG, cuando la PCR es positiva, indica la existencia de un proceso inflamatorio, pero no ofrece datos sobre sus causas.
En relación con los métodos para la determinación de la PCR, también existen ventajas si los comparamos con la VSG.
La VSG, cuando se determina con métodos manuales, requiere de pipetas especiales, de una observación estricta de la relación anticoagulante-sangre, de la colocación de la pipeta cargada en un soporte en posición vertical y del reposo durante 1 hora. Cualquier variación en las condiciones antes señaladas, causa errores groseros en los resultados. Para la VSG existen métodos automáticos que se reservan para los laboratorios que tienen una carga grande de trabajo, que justifique la adquisición de un equipo tan costoso para
realizar ese tipo de análisis.
En su determinación, la PCR ofrece las ventajas siguientes:
1. Prueba de aglutinación con látex, de fácil realización.
2. Ensayos inmunoenzimáticos manuales o automáticos (ELISA), nefelometría con láser, fluorescencia polarizada e inmunoturbidimetría. Ya sea el método manual o el automático, el tiempo consumido en su determinación no es mayor que 10 minutos y el material biológico es, por lo general, suero.
Aunque todavía la VSG se mantiene como una prueba de uso generalizado, tiene en la PCR una potente rival que ha ganado territorios diagnósticos en enfermedades como apendicitis, pancreatitis, enfermedades reumáticas (artritis reumatoidea) y cardiovasculares.
En este grupo de enfermedades y en los trastornos vasculares periféricos, la PCR es considerada un factor de riesgo. A partir de estudios publicados en 1997, se demostró la importancia de la PCR como agente predictivo de futuros IMA, o de la posible repetición del IMA cuando, después de ocurrido el primer ataque, sus valores se mantienen elevados.
Alfa 1 antitripsina. Es un inhibidor de la tripsina y la plasmina, por lo cual protege al cuerpo de la autodigestión. Se eleva en las reacciones de la fase aguda y en el embarazo. Su deficiencia es causa de enfisema pulmonar y falla hepática en la enfermedad homocigótica.
Alfa 1 glucoproteína ácida. Su función es des-conocida.
Su determinación se utiliza para seguir las reacciones de la fase aguda.
Haptoglobina. Se une a la hemoglobina libre en el suero. Se determina para el seguimiento de las reacciones de la fase aguda y en los procesos en los que ocurre hemólisis, como las reacciones postransfusionales y anemias hemolíticas, en las cuales su concentración disminuye al unirse a la hemoglobina libre que proviene de los eritrocitos destruidos.
C3 y C4. Los niveles del complemento aumentan en las reacciones inflamatorias (fase aguda). Sus valores disminuyen en las enfermedades autoinmunes.
Fibrinógeno. Es un factor de la coagulación de la sangre. Además, forma parte de los RFA, por lo que aumenta en las infecciones, en las reacciones inflamatorias y en el embarazo. Disminuye en los trastornos de la coagulación como la coagulación intravascular diseminada (CID), en las enfermedades de origen congénito y adquirido (hepatopatías).
Los solutos de mayor importancia biológica requieren portadores proteínicos, para atravesar la membrana, por procesos pasivos o activos.
El transporte activo usa energía para mover solutos cuesta arriba, en contra de un gradiente, en cambio en la difusión facilitada, los solutos se mueven cuesta abajo en favor del gradiente de concentración y no es necesario el uso de energía.
Mecanismos de intercambio o de Transporte celular
Transporte a través de membrana celular
Conociendo la estructura celular, sabemos que la bicapa lipídica de la membrana celular actúa como una barrera que separa dos medios acuosos, el medio donde vive la célula y el medio interno celular.
Las células requieren nutrientes del exterior y deben eliminar sustancias de desecho procedentes del metabolismo y mantener su medio interno estable. Para posibilitar este intercambio, la membrana celular presenta una permeabilidad selectiva, ya que permite el paso de pequeñas moléculas, siempre que sean lipófilas, pero regula el paso de moléculas no lipófilas.
Los mecanismos que permiten a las sustancias cruzar las membranas plasmáticas de las células son esenciales para la vida y la comunicación de las células. Para ello, la célula dispone de dos procesos:
• Transporte pasivo: cuando no se requiere energía para que la sustancia cruce la membrana plasmática.
• Transporte activo: cuando la célula utiliza ATP como fuente de energía para hacer atravesar la membrana a una sustancia en particular.
Transporte pasivo
Los mecanismos de transporte pasivo son:
• Difusión simple
• Osmosis
• Ultrafiltración
• Difusión facilitada
Difusión Simple
Las moléculas en solución están dotadas de energía cinética y, por tanto, tienen movimientos que se realizan al azar. La difusión consiste en la mezcla de estas moléculas debido a su energía cinética cuando existe un gradiente de concentración; es decir; cuando en una parte de la solución la concentración de las moléculas es más elevada.
La difusión tiene lugar hasta que la concentración se iguala en todas las partes y será tanto más rápida cuanto mayor sea la energía cinética (que depende de la temperatura) y el gradiente de concentración y cuanto menor sea el tamaño de las moléculas.
Algunas sustancias como el agua, el oxígeno, dióxido de carbono, esteroides, vitaminas liposolubles, urea, glicerina, alcoholes de pequeño peso molecular atraviesan la membrana celular por difusión, disolviendose en la capa de fosfolípidos.
Algunas sustancias iónicas también pueden cruzar la membrana plasmática por difusión, pero empleando los canales constituidos por proteínas integrales llenas de agua. Algunos ejemplos notables son el Na+, K+, HCO3, Ca++, etc. Debido al pequeño tamaño de los canales, la difusión a través de estos es mucho más lenta que a través de la bicapa fosfolipídica.
Osmosis
Es otro proceso de transporte pasivo, mediante el cual, un disolvente –el agua en el caso de los sistemas biológicos– pasa selectivamente a través de una membrana semipermeable.
La membrana de las células es una membrana semipermeable ya que permite el paso del agua por difusión pero no la de iones y otros materiales.
Si la concentración de agua es mayor (o, lo que es lo mismo, la concentración de solutos es menor) de un lado de la membrana que la del otro lado, existe una tendencia a que el agua pase al lado donde su concentración es menor.
El movimiento del agua a través de la membrana semipermeable genera un presión hidrostática llamada presión osmótica. La presión osmótica es la presión necesaria para prevenir el movimiento neto del agua a través de una membrana semipermeable que separa dos soluciones de diferentes concentraciones.
La ósmosis puede entenderse muy bien considerando el efecto de las diferentes concentraciones de agua sobre la forma de las células. Para mantener la forma de un célula, por ejemplo un hematíe, esta debe estar rodeada de una solución isotónica, lo que quiere decir que la concentración de agua de esta solución es la misma que la del interior de la célula. En condiciones normales, el suero salino normal (0,9% de NaCl) es isotónico para los hematíes.
Si los hematíes son llevados a una solución que contenga menos sales (se dice que la solución es hipotónica), dado que la membrana celular es semipermeable, sólo el agua puede atravesarla. Al ser la concentración de agua mayor en la solución hipotónica, el agua entra en el hematíe con lo que este se hincha, pudiendo eventualmente estallar (este fenómeno se conoce con el nombre de hemolisis.
Por el contrario, si los hematíes se llevan a una solución hipertónica (con una concentración de sales superior a la del hematíe) parte del agua de este pasará a la solución produciéndose el fenómeno de crenación y quedando los hematíes como "arrugados".
Ultrafiltración
En este proceso de transporte pasivo, el agua y algunos solutos pasan a través de una membrana por efecto de una presión hidrostática. El movimiento es siempre desde el área de mayor presión al de menos presión.
La ultrafiltración tiene lugar en el cuerpo humano en los riñones y es debida a la presión arterial generada por el corazón. Esta presión hace que el agua y algunas moléculas pequeñas (como la urea, la creatinina, sales, etcétera) pasen a través de las membranas de los capilares microscópicos de los glomérulos para ser eliminadas en la orina. Las proteínas y grandes moléculas como hormonas, vitaminas, etc., no pasan a través de las membranas de los capilares y son retenidas en la sangre.
Difusión facilitada
Algunas moléculas son demasiado grandes como para difundir a través de los canales de la membrana y demasiado insolubles en lípidos como para poder difundir a través de la capa de fosfolípidos. Tal es el caso de la glucosa y algunos otros monosacáridos. Esta sustancias, pueden sin embargo cruzar la membrana plasmática mediante el proceso de difusión facilitada, con la ayuda de una proteina transportadora.
En el primer paso, la glucosa se une a la proteína transportadora, y esta cambia de forma, permitiendo el paso del azúcar. Tan pronto como la glucosa llega al citoplasma, una kinasa (enzima que añade un grupo fosfato a un azúcar) transforma la glucosa en glucosa-6-fosfato. De esta forma, las concentraciones de glucosa en el interior de la célula son siempre muy bajas, y el gradiente de concentración exterior --> interior favorece la difusión de la glucosa.
La difusión facilitada es mucho más rápida que la difusión simple y depende:
• del gradiente de concentración de la sustancia a ambos lados de la membrana
• del número de proteínas transportadoras existentes en la membrana
• de la rápidez con que estas proteínas hacen su trabajo
La insulina, una hormona producida por el páncreas, facilita la difusión de la glucosa hacia el interior de las células, disminuyendo su concentración en la sangre. Esto explica el porqué la ausencia o disminución de la insulina en la diabetes mellitus aumenta los niveles de glucosa en sangre al mismo tiempo que obliga a las células a utilizar una fuente de energía diferente de este monosacárido.
Transporte activo y otros procesos activos
Algunas sustancias que son necesarias en el interior de la célula o que deben ser eliminadas de la misma no pueden atravesar la membrana celular por ser muy grandes, por llevar una carga eléctrica o porque deben vencer un gradiente de concentración.
Para estos casos, la naturaleza ha desarrollado el transporte activo, un proceso que consume energía y que requiere del concurso de proteínas integrales que actúan como "bombas" alimentadas por ATP, para el caso de moléculas pequeñas o iones y el transporte grueso específico para moléculas de gran tamaño como proteínas y polisacáridos e incluso células enteras como bacterias y hematíes.
Transporte activo
Por este mecanismo pueden ser transportados hacia el interior o exterior de la célula los iones H+ (bomba de protones) Na+ y K+ (bomba de sodio-potasio), Ca++, Cl-, I, aminoácidos y monosacáridos.
Hay dos tipos de transporte activo:
Transporte activo primario: en este caso, la energía derivada del ATP directamente empuja a la sustancia para que cruce la membrana, modificando la forma de las proteínas de transporte (bomba) de la membrana plasmática.
El ejemplo más característico es la bomba de sodio potasio (Na+/K+), que mantiene una baja concentración de Na+ en el citosol extrayéndolo de la célula en contra de un gradiente de concentración. También mueve los iones K+ desde el exterior hasta el interior de la célula pese a que la concentración intracelular de potasio es superior a la extracelular. Esta bomba debe funcionar constantemente ya que hay pérdidas de K+ y entradas de Na+ por los poros acuosos de la membrana.
Esta bomba actúa como una enzima que rompe la molécula de ATP y también se llama bomba Na+/K+-ATP'asa. Todas las células poseen cientos de estas bombas por cada mµ2 (milimicra cuadrada) de membrana.
Transporte grueso
Algunas sustancias más grandes como polisacáridos, proteínas y otras células cruzan las membranas plasmáticas mediante varios tipos de transporte grueso:
Endocitosis: es el proceso mediante el cual la sustancia es transportada al interior de la célula a través de la membrana.
Se conocen tres tipos de endocitosis:
• Fagocitosis: en este proceso, la célula crea proyecciones de la membrana y el citosol llamadas pseudópodos que rodean la partícula sólida. Una vez rodeada, los pseudópodos se fusionan formando una vesícula alrededor de la partícula llamada vesícula fagocítica o fagosoma. El material sólido dentro de la vesícula es seguidamente digerido por enzimas liberadas por los lisosomas.
Los glóbulos blancos constituyen el ejemplo más notable de células que fagocitan bacterias y otras sustancias extrañas como mecanismo de defensa .
• Pinocitosis: en este proceso, la sustancia a transportar es una gotita o vesícula de líquido extracelular. En este caso, no se forman pseudópodos, sino que la membrana se repliega creando una vesícula pinocítica. Una vez que el contenido de la vesícula ha sido procesado, la membrana de la vesícula vuelve a la superficie de la célula.
De esta forma hay un tráfico constante de membranas entre la superficie de la célula y su interior.
• Endocitosis mediante un receptor: este es un proceso similar a la pinocitosis, con la salvedad de que la invaginación de la membrana sólo tiene lugar cuando una determinada molécula, llamada ligando, se une al receptor existente en la membrana.
Una vez formada la vesícula endocítica está se une a otras vesículas para formar una estructura mayor llamada endosoma. Dentro del endosoma se produce la separación del ligando y del receptor: Los receptores son separados y devueltos a la membrana, mientras que el ligando se fusiona con un liposoma siendo digerido por las enzimas de este último.
Aunque este mecanismo es muy específico, a veces moléculas extrañas utilizan los receptores para penetrar en el interior de la célula. Así, el HIV (virus de la inmunodeficiencia adquirida o del sida) entra en las células de los linfocitos uniéndose a unas glicoproteínas llamadas CD4 que están presentes en la membrana de los mismos.
Las vesículas endocíticas se originan en dos áreas específicas de la membrana:
• Los "hoyos recubiertos" ("coated pits") son invaginaciones de la membrana donde se encuentran los receptores.
• Los cavéolos son invaginaciones tapizadas por una proteína especializada llamada caveolina, y parece que juegan diversos papeles:
La superficie de los cavéolos dispone de receptores que pueden concentrar sustancias del medio extracelular.
Se utilizan para transportar material desde el exterior de la célula hasta el interior mediante un proceso llamado transcitosis. Esto ocurre, por ejemplo, en las células planas endoteliales que tapizan los capilares sanguíneos.
Están implicados en el proceso de envío de señales intracelulares: la unión de un ligando a los receptores de los cavéolos pone en marcha un mecanismo intracelular de envío de señales.
Exocitosis
Es el mecanismo por el cual las macromoléculas contenidas en vesículas citoplasmáticas son transportadas desde el interior celular hasta la membrana plasmática, para ser vertidas al medio extracelular.
Durante la exocitosis, la membrana de la vesícula secretora se fusiona con la membrana celular liberando el contenido de la misma. Por este mecanismo las células liberan hormonas (por ejemplo, la insulina), enzimas (por ejemplo, las enzimas digestivas) o neurotransmisores imprescindibles para la transmisión nerviosa.
Mediante este mecanismo, las células son capaces de eliminar sustancias sintetizadas por la célula, o bien sustancias de desecho.
En toda célula existe un equilibrio entre la exocitosis y la endocitosis, para mantener la membrana plasmática y que quede asegurado el mantenimiento del volumen celular.
Transcitosis
Es el conjunto de fenómenos que permiten a una sustancia atravesar todo el citoplasma celular desde un polo al otro de la célula. Implica el doble proceso endocitosis-exocitosis. Es propio de células endoteliales que constituyen los capilares sanguineos, transportándose así las sustancias desde el medio sanguineo hasta los tejidos que rodean los capilares.
